Proteinkristallisation

  • Forschungsthema:Zur Verdampfungskristallisation von orthorhombischen Lysozymkristallen
  • Typ:Bachelorarbeit (experimentell)
  • Datum:abgeschlossen
  • Betreuer:Barros Groß
  • Bearbeiter:Sophia Gierse
  • Kristallin formulierte Proteine bieten gegenüber in Lösung vorliegenden oder lyophilisierten Proteinen bedeutende Vorteile hinsichtlich Lagerbeständigkeit, Produkthandling und Wirkstofffreisetzungsverhalten. Zudem gilt die Kristallisation als kostengünstige Möglichkeit, um ein Zielprotein mit hoher Reinheit aus einer verunreinigten Mutterlauge zu gewinnen. Trotz dieser einschlägigen Argumente steht die präparative Proteinkristallisation zum Zwecke der Formulierung und Aufreinigung noch im Anfangsstadium ihrer Entwicklung.

    Die zur Kristallisation benötigte Übersättigung wird bis heute in den meisten Fällen durch die Zugabe großer Mengen eines löslichkeitsmindernden Salzes, Polymers oder organischen Lösemittels (Präzipitant) zur Proteinlösung erreicht. Als Alternative zu diesem aus ökologischer Sicht wenig sinnvollen Kristallisationsprozess wurde am TVT in den letzten Jahren der Prozess der Niederdruck-Verdampfungskristallisation untersucht, welcher moderate Siedetemperaturen ermöglicht und sich im Falle des Proteins Lysozym als schonend, effektiv und kontrollierbar erwiesen hat. Findet diese Verdampfungskristallisation bei Siedetemperaturen >28 °C statt, so bilden sich orthorhombische, stäbchenförmige Lysozymkristalle, wohingegen sich bei niedrigeren Temperaturen tetragonale, isometrische Kristalle bilden.

    Für die Verdampfungskristallisation von tetragonalem Lysozym bei 24 °C konnte gezeigt werden, dass der Nukleationsschauer im nicht angeimpften Prozess von Experiment zu Experiment stark variiert, was schließlich zu einer nicht reproduzierbaren Kristallgrößenverteilung des Produktes führt. Durch Animpfen des Prozesses bei Übersättigungen zwischen des sogenannten „secondary nucleation threshold“ (SNT) und der metastabilen Zonengrenze (MZL) konnte hingegen kontrollierte, sekundäre Keimbildung herbeigeführt werden und durch geeignete Wahl der Impfparameter (z.B. Impfmasse) die Größenverteilung des Kristallisats gesteuert werden.

    Im Rahmen dieser Bachelorarbeit sollen diese Erkenntnisse nun auf die Kristallisation von orthogonalem Lysozym übertragen werden. Zur Auslegung des Prozesses und zur Berechnung der vorliegenden Lösungsübersättigungen soll hierfür zunächst eine Löslichkeitskurve bei der Prozesstemperatur von 35 °C ermittelt werden. Anschließend sind ungeimpfte und geimpfte Kristallisationsexperimente an der bereits vorhandenen Verdampfungskristallisationsapparatur im Liter-Maßstab bei 35 °C durchzuführen unter Variation von Verdampfungsrate, Impfmasse und Impfübersättigung. Nach Charakterisierung von Prozess und Produkt sollen die gewonnenen Erkenntnisse schließlich mit den bereits veröffentlichen Erkenntnissen zu isometrischen Lysozymkristallen verglichen und diskutiert werden.