Proteinkristallisation

  • Forschungsthema:Vom µL-Screening bis zur technischen Kristallisation von β-Lactoglobulin und BSA
  • Typ:Bachelorarbeit (experimentell)
  • Datum:abgeschlossen
  • Betreuer:Barros Groß
  • Bearbeiter:Annabelle Dietrich
  • Kristallin formulierte Proteine bieten gegenüber in Lösung vorliegenden oder lyophilisierten Proteinen bedeu-tende Vorteile hinsichtlich Lagerbeständigkeit, Produkthandling und Wirkstofffreisetzungsverhalten. Zudem gilt die Kristallisation als kostengünstige Möglichkeit, um ein Zielprotein mit hoher Reinheit aus einer verunreinigten Mutterlauge zu gewinnen. Trotz dieser einschlägigen Argumente steht die präparative Protein-kristallisation zum Zwecke der Formulierung und Aufreinigung noch im Anfangsstadium ihrer Entwicklung.

    Die zur Kristallisation benötigte Übersättigung wird bis heute in den meisten Fällen durch die Zugabe großer Mengen eines löslichkeitsmindernden Salzes, Polymers oder organischen Lösemittels (Präzipitant) zur Pro-teinlösung erreicht. Als Alternative zu diesem aus ökologischer Sicht wenig sinnvollen Kristallisationsprozess wurde am TVT in den letzten Jahren der Prozess der Niederdruck-Verdampfungskristallisation untersucht, welcher moderate Siedetemperaturen ermöglicht und sich im Falle des Proteins Lysozym als schonend, effektiv und kontrollierbar erwiesen hat.

    Um die Methode der Verdampfungskristallisation als tatsächliche Alternative zur Kristallisation von Proteinen zu etablieren, sollen im Rahmen dieser Bachelorarbeit die bisher gewonnenen Erkenntnisse auf weitere Pro-teine mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (u.a. isoelektrischer Punkt) und Molekülgrößen übertragen werden. Hierzu sollen das Milchprotein β-Lactoglobulin und das aus Rinderblut extrahierte Rinder-serumalbumin (BSA) zum Einsatz kommen.

    Da es für die beiden Proteine bislang keine geeigneten Daten gibt, welche die Auslegung eines solchen Pro-zesses ermöglichen würden, ist der erste Schritt die Durchführung von µ-batch Screeningexperimenten. Hier-durch soll das Phasenverhalten der Proteine unter verschiedenen physikochemischen Randbedingungen wie pH-Wert und Konzentrationen von Protein und Präzipitant charakterisiert werden. Die gebildeten Feststoff-Morphologien sowie die Löslichkeitskurve sollen in ternären Phasendiagrammen dargestellt werden. Anhand dieser Phasendiagramme sollen schließlich geeignete Bedingungen für die Verdampfungskristallisation im Technikumsmaßstab ermittelt werden. Abschließend sollen an der bereits vorhandenen Verdampfungskristal-lisationsapparatur Kristallisationsexperimente im Liter-Maßstab durchgeführt werden und das Produkt hin-sichtlich Kristallgrößenverteilung und –morphologie sowie Grad der Denaturierung beurteilt werden